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【2016年诺贝尔生理医学奖特别报导】发现自噬作用机制


2020-06-11

【2016年諾貝爾生理醫學獎特別報導】發現自噬作用機制

2016年诺贝尔生理医学奖桂冠,颁给发现自噬作用机制的日本细胞生物学家大隅良典教授。巨自噬作用 (Macroautophagy) 后来称作自噬作用 (autophagy),是演化保留下来的作用之一,因此真核生物能透过双层膜的囊泡 (vesicle),将所隔离的部分细胞质成分,运送至溶体 (lysosome) 进行消化,以便再利用。自噬作用与其它分解机制不同,它能移除存活时间长的蛋白质、巨分子複合体、以及已退化或受损的胞器。自噬作用调控饥饿状态下细胞内非重要成分的消化及再利用,以及参与移除细胞某些成分以提供空间给新成分的各种生理过程。此外,自噬作用是清除入侵微生物及毒性蛋白质聚合物的重要细胞机制,因此在感染、老化、及人类疾病的发病机制上,扮演重要的角色。

虽1960年代已观察到自噬作用,但仍长达数十年不甚了解其机制及生理相关性。大隅教授的研究,显着改变我们对此重要细胞机制的理解。1993年,大隅教授发表酵母菌自噬作用的15个关键基因,经一系列精巧的后续实验,他选殖(clone)酵母菌及哺乳动物细胞的许多关键基因,并阐明这些基因所编码蛋白质的功能。以大隅教授的开创性发现为基础,自噬作用已在人类生理及疾病机制上受到高度重视。

自噬作用的奥秘

1950年代初期,Christian de Duve对胰岛素的作用有兴趣,所以使用Albert Claude研发的细胞分离法,来研究葡萄糖-6-磷酸酶 (glucose-6-phosphatase) 在细胞内的作用位置。在控制组实验中,他也追蹤到酸性磷酸酶 (acid phosphatase) 的分布,但在新鲜的分离肝脏碎片中无法侦测到任何酵素活性。引人注目地,假如这些肝脏碎片保存在冰箱5天,又再度出现酵素活性。后来了解这是因为蛋白酶 (proteolytic enzymes) 被隔离在由de Duve命名的溶体 (lysosome) 中,它是过去未知的膜状构造。透过电子显微镜观察富含溶体的肝脏碎片及肝脏切片,确认溶体是细胞内的一种独特胞器。Christian de Duve、Albert Claude,以及George Palade,三人因发现溶体的构造与功能,共同荣获1974年诺贝尔生理医学奖桂冠。

发现溶体后不久,研究人员在小鼠肾脏正常发育期间,发现部分细胞质成分被隔离至膜状构造;而含有少量细胞质及粒线体的类似膜状构造,也出现在有水肾症状 (hydronephrosis) 的大鼠肾脏近端小管细胞 (proximal tubule cells) 中。在细胞退化早期,这种囊泡会和具有酸性磷酸酶的颗粒结合 (colocalize),且此构造数量会随着退化的进展而增加。含退化性细胞质的膜状构造也出现在正常大鼠肝细胞中,且当灌注升糖素 (glucagon perfusion)或暴露于有毒物质时,该构造的密度会大量增加。

了解溶体能消化细胞内部成分后,1963年Christian de Duve创造一新专有名词「自噬作用 (autophagy)」,数年后在一篇回顾论文中广泛讨论这个概念。当时,令人瞩目的是以电子显微镜观察到哺乳动物细胞的自噬作用。已知自噬作用会微量出现(low basal level),当各种组织进行分化或重整,包括大脑、肠道、肾脏、肺脏、肝脏、前列腺、皮肤、以及甲状腺,会增加自噬作用的发生。推测自噬作用可能是应付饥饿代谢压力的机制,且可能对疾病发病机制,扮演重要角色。因此,自噬作用广泛出现在各物种,如单细胞真核生物、多细胞动物如变形虫、眼虫 (Euglena gracilis)、眼原虫 (Tetrahymena)、昆虫、以及青蛙,显示自噬作用为一历经演化保存下来的功能。

接下来数十年,该领域的进展很有限。有研究指出营养物质与激素会影响自噬作用,在哺乳动物组织,胺基酸耗损会诱发自噬作用,胰岛素刺激会抑制自噬作用。另外,也有研究指出小分子3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine) 会抑制自噬作用。一篇结合细胞分离法 (cell fractionation)、自动放射照像术 (autoradiography),及电子显微镜的研究指出,自噬作用初期会出现双层膜构造-吞噬泡 (phagophore),然后向外延伸包覆部分细胞质,最后封闭成为缺乏水解酵素的囊泡 (vesicle) -自噬小体 (autophagosome)(图1)。

【2016年诺贝尔生理医学奖特别报导】发现自噬作用机制

儘管许多证据显示自噬可能是重要的细胞作用,但其机制及调控仍不明。当时只有少数几个实验室在研究此主题,主要是使用相关的或描述性的方法,聚焦于自噬作用晚期,也就是与溶体结合前后的步骤。现在我们已知自噬小体的存在短暂,且与溶体结合前仅存在约10~20分钟,使得其型态及生化研究都非常困难。

在de Duve提出「自噬作用」专有名词后将近30年,1990年代初期,自噬过程仍然是生物学上难以理解的问题。无法成功使用分子标记,且自噬作用机制的构成要素难以证实,许多基本的问题仍无法回答,例如自噬过程如何被诱发?自噬小体如何形成?自噬作用对细胞或个体存活有何重要性?自噬作用对人类疾病是否扮演重要角色?

发现自噬作用的机制

1990年代初期,当时是日本东京大学助理教授的大隅良典,决定使用出芽生殖的酵母菌Saccharomyces cerevisae作为模式生物,他所提出的第一个问题为自噬作用是否存在单细胞个体。酵母菌液泡的功能相当于哺乳动物的溶体(lysosome)。大隅教授推论,若酵母菌存在自噬作用,当抑制液泡内酵素,将会造成吞噬入液泡的细胞质成分累积。为验证该假说,他製作出缺少液泡蛋白酶如蛋白酶A、蛋白酶B、及羧基肽酶(carboxy-peptidase)的酵母菌品系。他发现在无营养的培养皿生长的基改酵母菌,使用光学显微镜就能观察到自噬颗粒(autophagic bodies)会累积在不正常液泡内,此特殊型态,使他确信能找到控制诱发自噬作用的基因。藉由诱发酵母菌细胞缺损液泡蛋白酶的随机突变,大隅教授发现第一个突变酵母菌无法在液泡累积自噬颗粒;他命名此基因为「autophagy 1 (APG1)」。他后来也发现,在氮源缺乏的培养基中,APG1突变酵母菌比野生型酵母菌较快失去存活能力。第2道筛选则使用较为便利的表现型及额外特徵,去辨识75个隐性突变,将它们分类成不同的互补群(complementation group)。1993年大隅教授发表在期刊FEBS论文指出,真核生物有高达15个基因对自噬作用的活化扮演重要角色;他将这些基因命名为APG1-15。因为新的自噬作用基因已确认存在于酵母菌及其它物种,所以统一的基因命名系统採用ATG简写来表示,本篇内文之后使用此命名。 

在接下来的数年,大隅教授选殖数个ATG基因及阐明这些基因编码蛋白质产物的功能。ATG1基因选殖显示,该基因编码「丝胺酸/苏胺酸激酶(serine/threonine kinase)」,证实在自噬作用扮演蛋白质磷酸化的角色;其它研究也显示蛋白质Atg1会与ATG13基因的蛋白质产物形成複合体,且受TOR激酶的调控。TOR在养分充足的细胞中会活化,且能高度磷酸化蛋白质Atg13以避免形成Atg13:Atg1複合体。相反地,当TOR因细胞饥饿而失去活性时,去磷酸化的蛋白质Atg13会与Atg1结合,活化自噬作用;接着,出现五角形複合体的活化激酶,包括Atg1、Atg13、Atg17、Atg29、及Atg31。该複合体的集合物是形成「自噬小体」阶梯式反应(cascade of events)的第1步骤。

自噬小体的形成,与膜主体蛋白Atg9、以及磷脂酸肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol-3 kinase;PI3K)複合体有关联,PI3K由液泡蛋白所组成,即液泡排列有关的蛋白质34(Vps34)、Vps15、Atg6、及Atg14。该複合体产生「磷脂酸肌醇-3磷酸盐(phosphatidylinositol-3-Phosphate)」及另外的Atg蛋白质被补充至吞噬泡(phagophore)的膜构造。吞噬泡藉由2个「类泛素蛋白接合阶层(ubiquitin-like protein conjugation cascades)」,向外扩展形成一成熟的自噬小体(autophagosome) (图2)。

【2016年诺贝尔生理医学奖特别报导】发现自噬作用机制

蛋白质Atg 8作用位置的研究显示,成长中酵母菌细胞的Atg 8在细胞质平均分布,但在饥饿酵母菌细胞,Atg 8 形成较大聚合物,并能结和在自噬小体及自噬颗粒上。大隅教授提出惊人的发现,Atg 8能否聚集在膜上决定于2个「类泛素接合系统 (ubiquitin-like conjugation systems)」,该系统能促进Atg 8共价键结合至膜脂质「磷脂醯乙醇胺 (phosphatidylethanolamine)」,这2个系统具有相同的活化酶Atg 7;第一次结合时,Atg12藉与Atg7的「半胱胺酸基 (cysteine residue)」形成硫酯键 (thioester bond) 而活化,然后转移至结合酶Atg10,以催化共价键结合至Atg5。进一步的研究显示,Atg12: Atg5聚合物会徵募Atg16去形成3分子複合体,于第2个类泛素蛋白接合系统作为接合酶(ligase),对自噬作用扮演重要角色。在第2个特殊反应,Atg8的C端精胺酸(arginine) 受Atg4移除,且成熟的Atg8接着受到Atg7活化,转移至Atg3接合酶。最后,这2个接合系统会合成Atg12: Atg5: Atg16接合酶,促使Atg8接合至「磷脂醯乙醇胺 (phosphatidylethanolamine)」。脂质化的Atg8是自噬小体 (autophagosome) 长度增加及融合的关键驱动因子。这2个结合系统,自酵母菌至哺乳动物,被高度保存下来。哺乳动物细胞中与酵母菌Atg8同源的蛋白质称为LC3(light chain 3),现今,萤光标识的LC3已被广泛用来作为自噬小体形成的生物标记。

大隅教授及研究团队首先在哺乳动物细胞,辨识出类似酵母菌ATG基因的同源物质,使自噬作用功能的研究得以在较高等的真核生物展开。不久之后,遗传学的研究发现,基因Atg5缺损小鼠在出生时明显正常,但因无法应付餵食前的饥饿,出生后第一天就死亡。藉由自噬机制缺损的基因剔除模式小鼠研究,已证实在各种哺乳动物组织,自噬作用的重要性。

大隅教授开创性研究引发自噬作用的广大兴趣,该领域已成为生医研究最密集的研究方向之一,从2000年代初期,发表论文数量即呈现显着增加。

不同类型的自噬作用

随着大隅教授具有发展性的研究,根据被分解的物质,现在可区别不同自噬作用类型。受到最广泛研究的自噬作用类型-巨自噬作用 (macroautophagy),能分解大部分细胞质及胞器。非选择性的自噬作用 (non-selective autophagy),能连续不断地发生,会受到如饥饿刺激有效地诱发。此外,针对特定基质(如蛋白质聚合物、细胞质内胞器、或入侵病毒或细菌)的选择性自噬作用 (selective autophagy),,需要靠某些特定的接合分子,来辨识这些物质,运送至「自噬小体膜 (autophagosomal membrane)」上的Atg8或LC3。其它自噬作用类型包括「微自噬作用 (microautophagy)」,藉由「溶体膜 (lysosomal membrane)」向内摺叠直接吞噬细胞质成分,以及「伴护蛋白调控的自噬作用 (chaperone-mediated autophagy)」,具特定辨识讯号蛋白质,能藉键结至「伴护蛋白複合体 (chaperone complex)」,直接运送至溶体 (lysosome)。

健康与疾病的自噬作用

自噬作用分子特徵所提供的观点,有助于进一步理解在细胞生理学及各种病理状态下,自噬作用的过程及关连性(图3)。自噬作用最初被认为是细胞对刺激所产生的反应,但现在已了解该作用不断地在进行基础运作;不同于「泛素蛋白酶体系统 (ubiquitin-proteasome system)」优先分解存活时间较短的蛋白质,自噬作用能移除存活时间较长的蛋白质,是唯一能破坏整个胞器如粒线体 (mitochondria)、过氧化体(peroxisomes)、及内质网 (endoplasmic reticulum) 的作用。因此,自噬作用对维持细胞恆定,扮演重要的角色。此外,自噬作用参与各种生理过程,例如需移除大量细胞质的细胞分化及胚胎发育。不同类型的刺激能快速诱发自噬作用,构成细胞保护功能的基础,能对抗细胞受损与老化有关连的许多疾病。

【2016年诺贝尔生理医学奖特别报导】发现自噬作用机制

因为非正常运作的自噬作用常与人类各种的疾病直接或间接有关连,使得自噬作用成为疾病治疗特别感兴趣的标的。第一个自噬作用与疾病相关的例子,是来自蛋白质Beclin-1的观察,Beclin-1是基因BECN1的产物,在多数人类乳癌及卵巢癌中皆出现突变。BECN1是酵母菌调节自噬作用启动步骤基因ATG6的同源物质,这个发现使自噬作用在癌症所扮演角色,受到广大的重视。

摺叠错误的蛋白质易形成不可溶的聚合物,对细胞具有毒性,细胞仰赖自噬作用来处理此问题。在神经退化疾病的果蝇及小鼠模式生物,藉抑制TOR激酶来活化自噬作用,能减少蛋白质聚合物的毒性。另外,脑组织的基因Atg5Atg7受损,会造成小鼠脑部失去自噬作用,引起神经退化。许多人类体染色体隐性遗传并伴随自噬作用受损的疾病,会导致大脑畸形、发育迟缓、智商不足、癫痫、运动不协调、及神经退化等特徵。

自噬作用能消除入侵微生物,该现象称为异源吞噬(xenophagy),对活化免疫反应及感染性疾病的控制扮演关键角色。病毒及细胞内细菌已发展出精巧的策略来迴避细胞防御。另外,微生物能利用自噬作用来维持它们自身的成长。

结论

大隅教授发现自噬作用基因及阐明自噬作用的分子机制,引导一个新的典範去理解细胞如何再利用它自己的成分。因为他的开创性研究,自噬作用已被确认为细胞生理学的一个基本作用,对人类健康及疾病具有重要涵义。


名词解释


内文及图片来源 

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2016/advanced-medicineprize2016.pdf


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